FRET პეპტიდის ტექნოლოგია

ფლუორესცენტული რეზონანსული ენერგიის გადაცემა (FRET)

ფლუორესცენტული რეზონანსული ენერგიის გადაცემა (FRET) არის არარადიაციული ენერგიის გადაცემის პროცესი, რომლის დროსაც დონორის აღგზნებული მდგომარეობის ენერგია გადადის მიმღების აღგზნებულ მდგომარეობაში ინტერმოლეკულური ელექტრული წყვილების ურთიერთქმედების გზით.ეს პროცესი არ მოიცავს ფოტონებს და ამიტომ არის არარადიაციული.ამ ანალიზს აქვს უპირატესობები, რომ არის სწრაფი, მგრძნობიარე და მარტივი.

FRET ანალიზში გამოყენებული საღებავი შეიძლება იყოს იდენტური.მაგრამ უმეტეს აპლიკაციებში, რეალურად გამოიყენება სხვადასხვა საღებავები.მოკლედ, მანათობელი რეზონანსული ენერგიის გადაცემა არის წყვილი დიპოლების გადატანა დონორიდან (საღებავი 1) მიმღებზე (საღებავი 2), როდესაც დონორი ჯგუფი აღფრთოვანებულია.ზოგადად, დონორის ფლუოროფორის ჯგუფის ემისიის სპექტრი ემთხვევა აქცეპტორის ჯგუფის შთანთქმის სპექტრს.როდესაც ორ ფტორფორს შორის მანძილი სათანადოა (10-100 ა), შეიძლება შეინიშნოს ფტორფორის ენერგიის გადაცემა დონორიდან მიმღებამდე.ენერგიის გადაცემის მეთოდი დამოკიდებულია რეცეპტორის ქიმიურ სტრუქტურაზე:

1. გარდაიქმნება მოლეკულურ ვიბრაციად, ანუ ქრება ენერგიის გადაცემის მანათობელი შუქი.(რეცეპტორი არის სინათლის ჩაქრობა)

2. ემისია უფრო ინტენსიურია, ვიდრე თავად რეცეპტორი, რაც იწვევს მეორადი ფლუორესცენციის სპექტრის წითელ გადანაწილებას“.(რეცეპტორები არის მანათობელი გამოსხივება).

დონორი ჯგუფი (EDANS) და მიმღები გენი (DABCYL) ერთნაირად არის დაკავშირებული აივ პროტეაზას ბუნებრივ სუბსტრატთან, და როდესაც სუბსტრატი არ არის გათიშული, DABCYL-ს შეუძლია ჩაახშოს EDANS და შემდეგ გახდეს შეუმჩნეველი ფტორისთვის.აივ-1 პროტეაზას გათიშვისას, EDANS აღარ კვდება DABCYL-ით და EDANS ლუციფერაზების შემდგომი აღმოჩენა შესაძლებელია.პროტეაზას ინჰიბიტორების ხელმისაწვდომობის მონიტორინგი შესაძლებელია EDANS-ის ფლუორესცენციის ინტენსივობის ცვლილებებით.

FRET პეპტიდები არის მოსახერხებელი ინსტრუმენტი პეპტიდაზას არასპეციფიკურობის შესასწავლად.ვინაიდან მისი რეაქციის პროცესის მუდმივი მონიტორინგი შესაძლებელია, ის უზრუნველყოფს ფერმენტის აქტივობის გამოსავლენად მოსახერხებელ მეთოდს.დონორის/აქცეპტორის მიერ პეპტიდური ობლიგაციების ჰიდროლიზის შემდეგ წარმოქმნილი ბზინვარება უზრუნველყოფს ფერმენტის აქტივობის საზომს ნანომოლარულ კონცენტრაციებში.როდესაც FRET პეპტიდი ხელუხლებელია, ის აჩვენებს შიდა ციმციმის უეცარ გაქრობას, მაგრამ როდესაც ნებისმიერი პეპტიდური ბმა დონორის/მიმღების საპირისპიროდ იშლება, ის ათავისუფლებს ციმციმს, რომელიც შეიძლება მუდმივად გამოვლინდეს და შემდეგ ფერმენტის აქტივობა შეიძლება დადგინდეს რაოდენობრივად.